مکان یابی سلولی پروتئین های سرکوبگر خاموشی در دو ویروس کوتولگی زردی غلات

نوع مقاله : مقاله کامل پژوهشی

نویسنده

-

چکیده

ویروس های زردی غلات از مخرب ترین ویروس های غلات در سراسر دنیا هستند. در این تحقیق پروتئین های P0، سرکوبگرهای خاموشی، در دو ویروس کوتولگی زرد غلات، Cereal yellow dwarf virus-RPV (CYDV-RPV) وCereal yellow dwarf virus- RPS (CYDV-RPS) از نظر محل تجمع و قرارگیری در سلول های گیاه توتون مورد بررسی قرار گرفتند. بدین منظور ترادف ژن های P0 پس از تکثیر در آزمون زنجیره ای پلیمراز (PCR)، با روش Gateway همسانه سازی شدند. سپس سازه های این ژن ها در اتصال با ژن کد کننده green fluorescent protein (GFP) وارد باکتری Agrobacterium tumefaciens شدند و با تزریق باکتری حامل این سازه ها به گیاه به صورت موقتی بیان شدند. پس از 24 ساعت از زمان تزریق، محل قرارگیری این پروتئین ها در سلول های گیاه توسط میکروسکوپ کانفوکال (confocal) مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که محل تجمع پروتئین P0 در هر دو ویروس در هسته و سیتوپلاسم است اما تمایل آنها برای تجمع متفاوت است. به عبارت دیگر پروتئین P0 در ویروس RPV CYDV- در مقایسه با CYDV-RPS تمایل کمتری برای تجمع در هسته دارد در حالی که پروتئین P0 در ویروس CYDV-RPS بیشتر در هسته متمرکز است. در آزمون لکه برداری وسترن با استفاده از آنتی بادی پلی کلونال GFP، پروتئین های GFP:P0 ردیابی شدند ولی پروتئین GFP به تنهایی دیده نشد که نشان می دهد محل های تجمع دیده شده مربوط به پروتئین های GFP:P0 است.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Subcellular localization of silencing suppressor proteins encoded by two cereal yellow dwarf viruses

نویسنده [English]

  • R. Almasi
-
چکیده [English]

Cereal yellow dwarf viruses are among the most destructive cereal viruses worldwide. In this study, subcellular localizations of silencing suppressor proteins ( P0) from two cereal yellow dwarf viruses, Cereal yellow dwarf virus-RPV (CYDV-RPV) and Cereal yellow dwarf virus-RPS (CYDV-RPS), were examined via confocal microscopy. To do so, P0 genes were synthesized by polymerase chain reaction (PCR) and were cloned through Gateway cloning system. Agrobacterium. tumefaciens clones harboring GFP:P0 constructs were infiltrated into Nicotiana benthamiana plants. Transient expression of P0 proteins with N-terminal GPF fusion enabled us to examine their subcellular localizations in plant cells, 24 hours post infiltration. Results showed that both proteins are nuclear-cytoplasmic but different tendencies were observed in their localizations. In other words, P0 of CYDV-RPS was more nuclear oriented than P0 of CYDV-RPV. In the Western blot analysis using GFP polyclonal antibody only GFP:P0 proteins but no free GFP, were detected indicating that localizations were related to GFP:P0 proteins.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Polerovirus
  • P0 protein
  • Gateway cloning
  • Western blot
  • subcellular localization
Almasi R., Miller W.A., and Ziegler-Graff V. 2015. Mild and severe yellow dwarf viruses differ in silencing suppression activity. Virus Research 208: 199-206.
De Cillia J., Mutterer J., Bortolamoi D., and Ziegler-Graff V. 2010. The Polerovirus: vascular movement and suppression of RNA silencing. Virologie14: 377-392.
Downey N. 2003 Extraction of DNA from agarose gels, pp.137-139. In: N. Casali., A. Preston, (Eds). E. coli Plasmid Vectors. Methods in Molecular Biology vol 235. Humana Press.
Dunoyer P., Pfeffer S., Fritsch C., Hemmer O., Voinnet O., and Richards K.E. 2002. Identification, subcellular localization and some properties of cystein-rich suppressor of gene silencing encoded by peanut clump virus. The Plant Journal 29: 555-567.
Han Y.H., Xiang H.Y., Wang Q., Li Y.Y., Wu W.Q., Han C.G., Li D.W., and Yu J.L. 2010. Ring structure amino acids affect the suppressor activity of melon aphid-borne yellows virus P0 protein. Virology 406: 21-27.
Hartley J.L., Temple G.F., and Brasch M.A. 2000. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Research 10: 1788-95.
Henry M., Beckett R., and Miller, W.A. 2004. Cereal yellow dwarf associated with CYDV-RPS, pp. 561-562. In: H. Lapierre, P. A. Signoret, (Eds). Viruses and Virus Diseases of Poaceae (Graminae). INRA Press, Paris.
Karimi M., Inze D., and Depicker A. 2002. GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends in Plant Science 7: 193-195.
Kozlowska-Makulska A., Guilley H., Szyndel M.S., Beuve M., Lemaire O., Herrbach E., and Bouzouba S. 2010. P0 proteins of European beet-infecting poleroviruses display variable RNA silencing suppression activity. Journal of General Virology 91: 1082-1091.
Krueger E.N., Beckett R.J., Gray S.M., and Miller W.A., 2013. The complete nucleotide sequence of the genome of Barley yellow dwarf virus-RMV reveals it to be a new Polerovirus distantly related to other yellow dwarf viruses. Frontiers in Microbiology 4: 205-210.
Landy A. 1989. Dynamic, structural, and regulatory aspects of Lambda site-specific recombination. Annual Review of Biochemistry 58: 913-949
Lapierre H., Henry M., Beckett R., and Miller W.A. 2004. Cereal yellow dwarf associated with CYDV-RPV, pp. 563-565. In: H. Lapierre, P. A. Signoret (Eds). Viruses and Virus Diseases of Poaceae (Graminae). INRA Press, Paris.
Ma Z., and Zhang X. 2018. Actions of plant Argonautes: predictable or unpredictable? Current Opinion in Plant Biology 45: 59-67.
Mangwende T., Wang M.L., Borth W., Hu J., Moore P.H., Mirkov T.E., and Albert H.H. 2009. The P0 gene of sugarcane yellow leaf virus encodes an RNA silencing suppressor with unique activities. Virology 384: 38-50.
Miller W.A. and Rasochova L. 1997. Barley yellow dwarf viruses. Annual Review of Phytopathology 35: 167-190.
Miller W.A., Beckett R. and Liu, S. 2002. Barley yellow dwarf virus: Luteoviridae or Tombusviridae? Molecular Plant Pathology 3:177–183.
Pazhouhandeh M., Dieterle M., Marrocco K., Lechner E., Berry B., Brault V., Hemmer O., Kretsch T., Richards K.E., Genschik P. and Ziegler-Graff V. 2006. F-box-like domain in the polerovirus protein P0 is required for silencing suppressor function. Proceedings of National Academy of Science USA 103: 1994-9.
Pfeffer S., Dunoyer P., Hei F., Richards K.E., Jonard G., and Ziegler-Graff V. 2002. P0 of Beet Western yellows virus is a suppressor of posttranscriptional gene silencing. Journal of Virology 76: 6815-6824.
Sadowy E., Maasen A., Juszczuk M., David C., Zagorski-Ostoja W., Gronenborn B. and Hulanicka, M.D. 2001. The ORF0 product of potato leafroll virus is indispensable for virus accumulation. Journal of General Virology 82: 1529-32.
van der Wilk F., Verbeek M., Dullemans A.M., and van den Heuvel J.F. 1997. The genome-linked protein of potato leafroll virus is located downstream of the putative protease domain of the ORF1 product. Virology 234: 300-303.
Voinnet O., Pinto Y.M., and Baulcombe, D.C. 1999. Suppression of gene silencing: a general strategy used by diverse DNA and RNA viruses of plants. Proceedings of National Academy of Science USA 96: 14147-14152.
Ziegler-Graff V., Brault V., Mutterer J.D., Simonis M.T., Herrbach E., Guilley H., Richards K.E. and Jonard G. 1996. The coat protein of beet western yellows luteovirus is essential for systemic infection but the viral gene product P29 and P19 are dispensable for systemic infection and aphid transmission. Molecular Plant Microbe Interaction 9: 501-10.